课程编码：1441015（实验大纲）

学    时：36课时

课程属性：必修（非独立设课）

开课专业：食品科学与工程

先修课程：有机化学、无机化学、分析化学

一、实验性质

食品微生物学实验是在微生物学理论的基础上进行的一门具有独立操作和技能的必修课，主要起到使学生掌握微生物研究的基本技能和基本方法。是微生物学科重要的组成部分，同时对微生物学在食品工业中的应用有概括性的学习。

二、实验教学目的和要求

食品微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。

为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：

1、每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2、认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3、实验室内应保持整洁、勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

4、实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。

5、实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。

6、使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7、每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐。擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去。如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间：凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮捧等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒：

8、每次实验需进行培养的材科，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养：实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外：

9、每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅：

10、离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。

三、实验项目名称和学时分配

四、实验项目具体内容

实验项目（一）：显微镜的构造、性能和使用

实验目的：理解并掌握显微镜的构造、性能和使用；

实验内容：1、取镜  显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图Ⅰ-3

    1. 物镜转换器  2. 接物镜  3.游标卡尺  4.载物台  5.聚光器  6. 彩虹光阑   7.光源   8. 镜座   9. 电源开关    10. 光源滑动变阻器   11. 粗调螺旋   12. 微调螺旋  13.  镜臂14.镜筒  15.目镜  16.标本移动螺旋

2、调节光源

   1) 将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。

   2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。

   3) 开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。

一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。

   3、低倍镜观察  低倍物镜(8´或10´)视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：

   1) 先将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)，并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。

   2) 双眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。

   3) 移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。

   4、高倍镜观察  将高倍物镜(40´)转至镜筒下方(在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。

   5、油镜观察

   1) 用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。

   2) 双眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

   3) 如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。

   4) 观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。

   5) 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。

注意事项：

1、显微镜镜头的保护和保养

2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线

预习要求：熟悉显微镜的结构和操作

实验项目（二）：细菌的革兰氏染色法

实验目的：通过本实验使掌握革兰氏染色法的操作，观察革兰氏阴性菌和阳性菌

实验内容：

1、涂片  在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。

2、固定  将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

3、 染色

⑴初染  将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。

⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。

⑶脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。

⑷复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。

   4、镜检  干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G⁺)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G^-)。

注意事项：

1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。

2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

预习要求：熟悉革兰氏染色法的原理

实验项目（三）：酵母菌形态观察与死活细胞鉴别

实验目的：⑴观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

⑵掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

实验内容：⑴美蓝浸片的观察

a.在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。

染液不宜过多或过少，否则，再盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。  

b.用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。

盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。

c.将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

d.染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

e.用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。

⑵水-碘液浸片的观察

 在载玻片中央加一滴革兰氏染色用碘液，然后再其上加3小滴水，取少量酵母菌苔放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

预习要求：熟悉酵母菌的形态结构。

实验项目（四）：  微生物的显微镜直接计数法

   实验目的：使学生掌握酵母的计数方法。

    1、视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释(斜面一般稀释到10^-2)，以每小格的菌数可数为度。

    2、取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。

    3、将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

    4、静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

    5、计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

    6、凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数

7、血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。

注意事项：

1、 加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡。

2、 由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱性美蓝染液处理酵母菌液。

预习要求：熟悉血球计数板的使用方法

实验项目（五）：培养基的制备和灭菌

实验目的：使学生了解培养基的类型、作用以及配置方法。

实验内容：

1、计算称量  根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。

   2、溶解  一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，补足水分到需要的总体积。

   3、调节pH  用滴管逐滴加入1N NaOH或lN HCl边搅动；边用精密的pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。pH值也可用pH计来测定。

   4、过滤  要趁热用四层纱布过滤。

5、分装  按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。

6、加塞  培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞或硅胶塞。作用有二：一是阻止外界微生物进入培养基内引起污染；二是保证良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。

7、灭菌  在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。如果分装的斜面，要趁热摆放并使斜面长度适当(为试管长度1/3-l/2，不能超过1/2)。培养基经灭菌后，应保温培养2-3天，检查灭菌效果，无菌生长者方可使用。

注意事项：

1、 琼脂应先行用冷水浸泡，纱布过滤，在调好pH值后加入。

2、 配制高氏一号合成培养基时应小心溶解淀粉，不要成团。

预习要求：熟悉培养基的类型

实验项目（六）： 微生物平板菌落计数

实验目的：使学生掌握怎样对平板上的菌落进行计数。

实验内容：

1、样品稀释液的制备，10倍梯度法。

2、平板接种培养，将稀释好的菌液进行平板涂布。

3、结果计算  计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中，选择一个合适的稀释度，求出每克待测样品中的含菌数。

⑴从三个稀释度中先出一个稀释度(即计算稀释度)，每个平皿中的菌落数，细菌、放线菌、酵母菌以每皿30-300个菌落为宜，霉菌以每皿10-100个菌落为宜。这是因为稀释度过高，菌数少，误差大，稀释度过低菌数多，不易得到分散的菌落，也不易数清。选出计算稀释度后，数出该稀释度中三个重复的菌落数，并求出平均的菌落数。

⑵同一稀释度的各个重复的菌数相差(平行误差)不能太悬殊。

⑶从低稀释度到高稀释度，以菌落数递减10倍为标准，各稀释度间的误差(递减误差)越小越好。

⑷含菌数的计算  含菌数通常以每克样品(烘干重或风干重)中含有的测定菌的数量来表示，可按下面的公式计算。

注意事项：

（1）在整个实验过程中的无菌操作。

（2）应根据实验所测的样品决定最高稀释度。

（3）混菌法倒培养基时应当注意培养基不能过烫或过冷。

预习要求：熟悉平板菌落计数的方法

实验项目（七）： 微生物的平板划线分离纯化

实验目的：使学生掌握怎样分离纯化微生物

实验内容：

   1、倒平板  将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和孟加拉红培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。    

2、划线  在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平板上划线(图Ⅴ-3)。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：

图Ⅴ-3  平板划线操作示意图

⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。

⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。

  3、挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

注意事项：

1、在倒平板时可在培养基中添加某些药物如在高氏一号合成培养基中加10%的酚，在马铃薯蔗糖培养基中加入链霉素(30mg/ml)，这样可减少所不需的杂菌。

2、实验操作过程中无菌操作。

预习要求：熟悉微生物平板划线的方法

实验项目（八）： 霉菌形态的观察

实验目的：使学生掌握如何观察霉菌的形态

实验内容：

1、在洁净载玻片上，滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液l滴。

2、剪取一小块用玻璃纸透析培养的带有根霉菌丝和孢子的玻璃纸，先放在50%乙醇中浸一下，以赶走菌体上的气泡，再放在载玻片上的乳酸石炭酸棉蓝染色液中。

3、加盖玻片，用显微镜进行观察，注意观察根霉假根的形态。

注意事项：

1、 根霉培养注意控制时间和菌丝生长长度。

2、 用50%的乙醇浸泡时应浸透，洗去部分孢子。

3、 加盖玻片时注意不要产生气泡，并不要再移动盖玻片，以免弄乱菌丝。

预习要求：熟悉不同霉菌的形态特征

实验项目（九）： 化学因素对微生物的影响

实验目的：了解常用化学消毒剂对微生物的作用。

实验内容：

⑴将已灭菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。

⑵用无菌吸管吸取0.2 ml培养18h的白色葡萄球菌菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

⑶将已涂布好的平板底皿划分成4～6等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。

⑷用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(D5 mm)分别浸入装有各种消毒剂溶液的试管中浸湿。无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。                                                                                                              

⑸将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃温室中，24h后取出观察抑（杀）菌圈的大小。

注意事项：

取出滤纸片时保证过滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致，并在试管内壁沥去多余药液。

预习要求：熟悉不同霉菌的形态特征